Escherichia coli

1.7. Patogenitate

1.7.1. Mecanismele patogenitatii

Patogenitatea la Escherichiei coli se poate datora producerii de toxine si / sau capacitatii de a se multiplica si de a invada tubul digestiv.

Pe baza mecanismului de actiune la nivelul tubului digestiv E. coli se impart in enteroinvazive si enterotoxice. Enteroinvazivitatea este determinata de posibilitatea penetrarii in epiteliul intestinal. Enterotoxicitatea se refera la producerea de toxine (33, 16). Factorii de toxicitate la Escherichia coli sunt reprezentati de enterotoxine, hemolizine si antigenul somatic O (9).

Au fost identificate mai multe enterotoxine, dintre care doua categorii sunt mai importante: enterotoxina termostabila (ST) si enterotoxina termolabila (LT). ST rezista la 100 °C 15 minute, are masa moleculara mica (1500 - 5000 daltoni) si este slab antigenica. LT are masa moleculara mare (86500 daltoni), prezinta o specificitate antigenica si imunogena bine exprimate, este asemanatoare cu toxina produsa de Vibrio cholere. Amindoua tipurile de toxina se pot intilni in cel putin doua forme: LT-I sau LT-II si ST-I sau ST-II. Enterotoxina termolabila (LT) este alcatuita din o subunitate A si 5 subunitati B (16, 32, 9).

Subunitatile B au rol de a lega toxina de receptorii enterocitelor (tabelul 3), iar subunitatea A patrunde in enterocit unde activeaza adenilat-ciclaza, creste nivelul de AMP-ciclic, scade reabsorbtia ionilor de sodiu si creste secretia de clor si bicarbonat. Consecinta va fi pierderea apei de catre enterocite si aparitia in lumenul intestinal a unui lichid bogat in electroliti, rezultind astfel diareea apoasa. Enterotoxina termostabila (ST), patrunsa in celule, activeaza guanilat-ciclaza, care va altera functia membranei enterocitelor, conducind la secretia de lichid in lumenul intestinal si aparitia diareei (11, 9).

Tabelul 3. Receptori ai enterotoxinelor produse de Escherichia coli (11)

Enterotoxina	Varianta	Receptorii membranari
Termostabil`	STa (ST-I)	Guanilat-ciclaza C
	STb (ST-II)	Sulfatide ]i alte molecule
Termolabil`	LT-Ip	Gangliozidul GM1 Galactoproteine Poliglicozilceramide
	LT-Ih	Gangliozidul GM1 Galactoproteine Poliglicozilceramide
	LT-IIa	Disialogangliozidul GD1b
	LT-IIb	Disialogangliozidul GD1a
Verotoxina	VT1 si VT2	Globotriozilceramida GB3 Galactozilglobotetraozilceramida GB5
	VTe (VT-IIv)	Globotetraozilceramida GB4

ETEC pot produce fie ambele tipuri de toxina, fie numai unul din ele (LT sau ST). Patogenitatea ETEC nu depinde numai de productia toxinelor ci si de capacitatea de fixare pe epiteliul intestinal cu ajutorul factorilor de adezivitate (fimbrii, pili) (42,36). Intr-o prima etapa se produce aderarea bacteriilor de epiteliul intestinal; in a doua etapa incepe producerea de toxine (22).

Sinteza enterotoxinelor este determinata prin plasmide, asemenea fimbriilor, ceea explica corelatia existenta intre enterotoxicitate si prezenta antigenelor fimbriale F₄ , F₅ F₆ , F₄₁ si F₁₈ (16, 36, 35).

LT-I, ST-I si ST-II au fost identificate la tulpini enterotoxigene izolate de la om si porc, in timp ce LT-II a fost izolata mai rar si numai de la porc (32).

Unele tulpini produc Shiga-toxine (verotoxine) (notate Stx, SLT sau VT) care sunt asemanatoare cu toxinele produse de Shigella dysenteriae. Asemanarea cea mai mare cu toxina Shiga o are VT1. Activitatea VT1 este neutralizata de anticorpi antitoxina Shiga, spre deosebire de VT2 care nu este neutralizata de acesti anticorpi (10). VT au doua subunitati: A si B. Subunitatea B este cea care determina fixarea toxinei de un receptor de pe membrana celulelor sensibile.

Dupa fixarea subunitatii B pe receptor toxina este captata in interiorul celulei si se elibereaza subunitatea A (10). VT1 si VT2 au fost gasite responsabile de colita hemoragica, sindromul hemolitic-uremic (32, 33) si purpura trombocitopenica la om (33). Varianta VT2e (notata si SLT-IIv) a fost izolata de la porci cu boala edemelor (19, 32) si exista si unele pareri ca ar fi implicata in aparitia sindromului diareic la purceii intarcati (33). Studiile au aratat ca Escherichia coli serotipul O₁₅₇:H₇ este producatoare de verotoxine: 90% din tulpinile studiate au produs VT1 si VT2, 4% au produs numai VT1 si 6% numai VT2 (106, 85). Se pare ca la serotipul O₁₅₇:H₇ s-a identificat si producerea de VT3 (10).

Anumite tulpini de E. coli pot sintetiza doua tipuri de toxine capabile sa determine o polinucleere a celulelor din culturs Vero si HeLa. Aceste toxine sunt letale pentru soarece si produc necroza pielii la iepure - de aceea au primit numele de "factori citotoxici necrozanti" (CNF1 si CNF2) (31, 23). Rolul acestor toxine in patogeneza infectiilor cu E. coli nu este inca bine stabilit. Tulpinile necrotoxigene (NTEC) producatoare de CNF1 au fost asociate cu infectii intestinale si extraintestinale la om si animale, iar tulpinile producatoare de CNF2 au fost izolate de la vitei cu diaree sau septicemie (23, 31).

CNF1 este codificata in cromozomi (23), pe cind CNF2 este codificata de gene situate intr-un plasmid transferabil notat "Vir" (CNF2 se mai poate intilni si sub numele de "toxina Vir"). Acelasi plasmid codifica si sinteza fimbriilor F₁₇ (31, 24).

Unele tulpini sunt hemolitice - produc hemolizine cu actiune litica asupra hematiilor de la diferite specii de animale. Sinteza hemolizinelor este codificata de un plasmid, notat "Hly" (9).

Antigenul somatic O protejeaza bacteria fata de sistemul de aparare al organismului infectat; efectele sale sunt de endotoxina (9).

1.7.2. Infectia naturala

1.7.2.1. Infectia naturala la suine

Colibacilozele suinelor se impart in infectii intestinale si extraintestinale. Cele mai grave infectii apar la purcei in perioda de la nastere pina la intarcare. Au repercursiuni economice importante datorita frecventei lor ridicate, mortalitatilor si scaderii sporului de crestere.

Infectiile intestinale sunt reprezentate in general de: diareea colibacilara, gastroenterita hemoragica si boala edemelor. Infectiile extraintestinale implica septicemii si poliserozite; mai rar mamite, cistite si pielonefrite (21).

· Diareea neonatala

Apare [n perioada de la fatare pina la virsta de 7-8 zile. Se manifesta prin diaree severa, deshidratare si moarte. Agentul principal este Escherichia coli enterotoxigena (ETEC). Morbiditatea poate fi uneori foarte ridicata. Vaccinarea anti-ETEC a scroafelor gestante scade frecventa diareei neonatale datorita aparitiei de anticorpi in colostru. Tulpinile ETEC implicate produc atit factori de aderenta (F₄ , F₅ , F₆ , F₄₁) cit si enterotoxine (LT, STa, STb).

Cele mai des intilnite tulpini ETEC apartin serogrupelor O₈ , O₁₄₇ , O₁₄₉ si O₁₅₇ , ce sunt asociate cu producerea adezinelor F₄ (K₈₈) si a enterotoxinelor STb si / sau LT. S-au mai izolat si ETEC apartinind serogrupelor O₈ , O₉ , O₆₄ si O₁₀₁ , asociate cu producerea adezinelor F₅ (K₉₉), F₆ , F₁₈ , F₄₁ si a enterotoxinei STa (1, 7, 18, 21).

· Diareea inainte de intarcare

Este mai putin severa decit diareea neonatala si mortalitatea este mai scazuta. Agentul etiologic poate fi ETEC singur sau asociat cu virusul GET, rotavirusuri sau coccidii. ETEC implicate apartin serogrupurilor O₈ , O₁₁₅ si O₁₄₇ , care produc enterotoxina STb si uneori LT, dar nu exprima adezine fimbriale cunoscute (21).

· Diareea purceilor intarcati

Pe linga factorii infectiosi este implicat in aparitia diareei si stresul de intarcare, corelat cu schimbarea alimentatiei. Anticorpii obtinuti din lapte[1] dispar la intarcare asa ca purceii devin susceptibili la infectii cu ETEC. Tulpinile de E. coli implicate apartin categoriilor ETEC, VTEC si EPEC.

ETEC include serogrupurile O₈ , O₉ , O₁₁₅ , O₁₃₈ , O₁₃₉ , O₁₄₁ , O₁₄₇ si O₁₅₇. 70% din ETEC implicate apartin serogrupelor O₁₄₁ , O₁₄₇ si O₁₅₇ , asociate frecvent cu producerea de adezine F₄(K₈₈) si enterotoxine STb si / sau LT.

VTEC produc verotoxine, cel mai adesea VT2e (SLT-IIv), care este mai putin enterotoxica deoarece purceii la aceasta virsta nu au inca dezvoltati receptorii pentru adezinele F₁₀₇ necesare atasarii VTEC.

EPEC (E. coli enteropatogena) apartinind serogrupelor O₄₅ si O₁₀₈ detin factorul EAE (factor de atasare si de distrugere a mucoasei intestinale). Nu poseda factorii EAF (factori de aderenta EPEC), nici factorul BFP (bundle forming pili ), factori ce apar la tulpinile EPEC patogene pentru om (27, 21).

· Gastroenterocolita hemoragica (enterotoxiemia colibacilara)

Apare adesea in perioada intarcarii, dar pot fi afectati si purceii sugari. Se manifesta clinic prin hipertermie, diaree, anorexie si moarte rapida. La necropsie se observa congestia tractusului intestinal, continut sangvinolent si necroz`a ischemica la nivelul stomacului si intestinului.

Sunt implicate cel mai frecvent serogrupele O₈ , O₁₄₉ , si O₁₅₇ , ce produc adezine F₄ , enterotoxine LT, STb si hemolizine.

Se pare ca mortalitatea se datoreaza socului endotoxic, ca urmare a colonizarii si proliferarii masive in intestin a Escherichiei coli care vor sintetiza adezine fimbriale si endotoxine in cantitate mare, eventual si o neurotoxina (16, 21).

· Boala edemelor

Se manifesta la grasuni. Este o angiopatie degenerativa ce duce la aparitia de edeme in diferite tesuturi, inclusiv in sistemul nervos central. A primit numele de "Boala edemelor" pentru ca cele mai evidente semne la examenul necropsic sunt edemul mucoasei stomacului si al mezocolonului. Clinic se mai observa: ataxie, convulsii, paralizii, diaree, edeme subcutane si perioculare. Morbiditatea este de 30 - 40%, iar mortalitatea poate ajunge la 90%. Sunt implicate tulpini de E. coli verotoxigene (VTEC).

VTEC asociate cu "Boala edemelor" sunt hemolitice si apartin serogrupelor O₁₃₈ , O₁₃₉ si O₁₄₁. Ele au fost detectate ca detinatoare ale genelor ce codifica sinteza adezinei F₁₀₇ (F₁₈), dar pot exista si tulpini F₁₀₇ negative.

VTEC produc o toxina care a fost denumita EDP (edema disease principle), toxina ce apartine grupului verotoxinelor (VT) si care in prezent este denumita VTe sau SLT-IIv. Inocularea intravenoasa de VTe purificata a reprodus semnele clinice si leziunile bolii (19, 21).

· Colibaciloza sistemica (septicemia cu E. coli)

Boala apare sporadic, in jurul virstei de 80 zile. Purceii afectati mor subit, sau in cazurile mai putin grave manifesta depresiune, diaree si dispnee. La necropsie se observa congestie hepatica, afectarea ganglionilor mezenterici si poliserozita fibrinoasa.

Sunt implicate cel mai adesea tulpini EHEC din serogrupele O₈ , O₁₄₁ , O₁₄₉ si O₁₅₇ , tulpini ce exprima adezine F₄ , produc aerobactina si sunt rezistente la efectul bactericid al serului. Unele dintre aceste tulpini sintetizeaza colicina V si produc o capsula ce exprima antigen K. Acest antigen K are rol in supravietuirea bacteriei in circulatia gazdei si creste rezistenta acesteia la fagocitoza (21).

1.7.2.2. Infectia naturala la bovine

Escherichia coli la bovine este implicata in principal in aparitia diareei colibacilare, colisepticemiilor si mamitelor.

· Diareea colibacilara

Este produsa de tulpini enterotoxigene (ETEC), verotoxigene (VTEC) si enteropatogene (EPEC).

ETEC apartin in general serogrupelor O₈ , O ₉ , O₂₀ si O₁₀₁ , tulpini ce pot sintetiza adezine F₅ (K₉₉) si o enterotoxina termostabila STa. Diareea apare la viteii nou-nascuti. Colonizarea intestinului are loc numai in primele ore de la fatare, deoarece receptorii celulari pentru adezine dispar dupa 12 ore.

VTEC sunt producatoare de verotoxine VT1 sau VT2

EPEC nu sintetizeaza verotoxine si nici enterotoxine, ci produc numai leziuni de distrugere a microvilozitatilor (prin provocarea unei rearanjari a citoscheletului enterocitelor) (22).

· Colisepticemiile

Sunt implicate multe serotipuri, dar cele mai frecvente sunt O₇₈ , O₅₅ , O₈₆ si O₁₅. Infectia se produce in primele 2-3 zile de viata pe cale digestiva sau ombilicala. Clinic se manifesta prin apatie, inapetenta, febra, semne nervoase, uneori si diaree. Moartea este rapida.

Tulpinile septicemice pot sintetiza doua tipuri de toxina: CNF1 si CNF2 (factori citotoxici necrozanti), plus adezine F₁₇ (31).

Tulpinile CNF1 pozitive produc aerobactina si sunt rezistente la actinea bactericida a serului.

Tulpinile CNF2 pozitive au fost izolate exclusiv de la rumegatoare. Unele nu produc aerobactina (30%) sau nu sunt rezistente la ser (20%).

Exista ]si tulpini CNF negative care pot produce septicemii (23, 22).

· Mamitele

Escherichia coli se asociaza frecvent cu Aerobacter aerogenes si Klebsiella pneumoniae. Boala evolueaza in doua forme clinice: forma cu paraplegie si forma fara paraplegie.

Forma fara paraplegie apare brusc. Starea generala se modifica foarte repede: febra (40 - 41 °C), anorexie, tremuraturi musculare, abatere. Local se constata ca unul sau doua sferturi (de regula posterioare) apare inflamat, de culoare rosie, turgescent, cald, sensibil. Secretia este seroasa, roz sau galbuie. Starea generala se inrautateste si apare enterita cu diaree redusa, pasagera, fetida, apoi se produce o constipatie. Poate apare moarte prin toxiemie.

Forma cu paraplegie debuteaza de obicei cu enterita. Semnele clinice sunt asemanatoare, dupa 2 - 3 zile insa, se observa tulburari nervoase la membrele posterioare: vaccilatii, dificultati la ridicare, pina la decubit lateral (13).

Bacteriile pot patrunde din mediu prin canalul galactofor, apoi se multiplica in laptele rezidual din sinusul galactofor. Factorii de virulenta ale tulpinilor responsabile de mamite nu au fost inca identificati. Se pare ca tulpinile pot poseda factori de aderenta dar nu s-au identificat ca fiind specifici (22).

1.7.2.3. Infectia naturala la pasari

La infectia naturala sunt receptive multe specii de pasari: gaina, curca, bibilica, fazanul, rata, gisca. Boala este mai frecventa la puii de gaina si la bobocii de rata si gisca. Infectia se produce mai frecvent pe cale respiratorie, mai rar digestiva (28, 30)

La necropsie se observa ca embrionii au aspect viscos, de culoare galben - verzuie. In forma acuta la puii de gaina se observa inflamatia seroaselor si a pericardului, hepatoza, splina marita, culoare de visina putreda. La adulte ficatul este marit, friabil, cu zone de hepatita hemoragico-necrotica, uneori peritonita fibrino-purulenta; enterita catarala cu puncte hemoragice pe seroasa intestinala. In forma cronica se constata noduli in diferite organe (intestin, ficat, rinichi, splina, cord, ovar, stomac glandular, pulmoni, piele). Marimea nodulilor este variabila: de la punctiformi la marimea unui ou (30).

Tulpinile izolate mai frecvent fac parte din serotipurile O₁ , O₂ si O₇₈. La acestea au fost identificate sinteza de aerobactina, existenta unei antigene capsulare K₁ , fimbrii F₁ si a unor fimbrii notate P. Unele tulpini sunt producatoare de toxine LT (28).

1.7.2.4. Infectia naturala la carnivore

Escherichia coli la carnivore este implicata in infectii intestinale (diareea colibacilara) si extraintestinale (septicemii, cistite, pielonefrite, metrite).

Au fost identificate tulpini ETEC si VTEC [n principal, mai rar tulpini EHEC si EPEC.

Tulpinile ETEC se remarca prin capacitatea lor de a produce enterotoxine termostabile (STa, STb) si termolabile (LT-I, LT-II).

VTEC pot produce verotoxine VT1, VT2 sau VT2v, unele tulpini pot sintetiza si factorul EAE (6).

1.7.2.5. Infectia naturala la iepure

Infectiile intestinale cu Escherichia coli, la iepure, sunt produse de tulpini enteropatogene (EPEC), mai ales in sistemul de crestere industrial. La iepurii domestici EPEC nu are un rol important in etiologia enteritelor.

Mecanismul patogenitatii consta in atasarea bacteriilor de mucoasa intestinala si distrugerea vilozitatilor. Bacilii nu produc enterotoxine ST sau LT cunoscute si nu sunt enteroinvazivi. S-au identificat si tulpini producatoare de VT1 sau de "toxina citoletala dilatanta" (CLDT) (20).

La nou-nascuti au fost identificate mai multe serotipuri responsabile de aparitia diareei: O₂ , O₈ , O₁₅ , O₁₀₃. Responsabile de diareea de dupa intarcare s-au gasit serotipurile: O₂₀ , O₁₀₉ , O₁₅₃ , O₁₂₈ , O₁₃₂ si O₂.

Numarul de colibacili din intestin este partial determinat si de concentratia de acizi grasi volatili (AGV) si de pH: la un pH de 6,5 si la o concentratie de AGV de 70 mmol / kg proliferarea E. coli este inhibata (20).

Sugarii sunt protejati in general contra colibacilozei neonatale prin prezenta de IgA in lapte chiar fara ca mama sa fi fost vaccinata (38).

Tabelul 4. Patologia indusa de Escherichia coli (35)

Categoria	Om	Rumegatoare	Porc	Iepure	Carnivore
Sistemice	Meningite neonatale	Septicemii	Septicemii
ETEC	Diaree	Diaree neonatal`	Diaree neonatala	Diaree neonatala	Diaree
VTEC	Colite hemoragice Sindromul H-U	Dizenterii	Boala edemelor		Diaree
EPEC	Diareea infantila de var`	Dizenterii	Diaree inainte si dupa intarcare	Diaree dupa
EIEC	Dizenterii
CNF	Infectii intestinale si extraintestinale

1.7.3. Infectia experimentala

S-au efectuat inoculari experimentale la diverse animale, dintre care si vitei, purcei, pui de gaina sau embrioni pentru a determina patogenitatea unor tulpini. Dintre numeroasele metode utilizate, cele mai frecvente sunt:

· Testul ansei ligaturate pe iepure - se efectueaza in scopul punerii in evidenta a capacitatii E. coli de a produce enterotoxine. Uneori da rezultate neconcludente din motive inca necunoscute. Se utilizeaza pentru tulpini de origine umana sau de provenienta necunoscuta.

· Testul ansei ligaturate pe purcei - se utilizeaza in aceleasi scopuri ca testul anterior, dovedindu-se calitativ superior fata de acesta. Este foarte sensibil si adecvat mai ales pentru tulpinile de provenienta porcina.

· Testul intragastric pe soareci sugari - este usor de efectuat, dar necesita multi soareci sugari si nu evidentiaza chiar toate tulpinile producatoare de enterotoxina termostabila (ST).

· Testul cutanat pe iepure - pentru evidentierea factorului de permeabilitate vasculara

· Testul Sereny (testul keratoconjunctivitei la cobai) - pentru cercetarea virulentei la tulpinile enteroinvazive de Escherichia coli care din punct de vedere antigenic sunt iinrudite cu Shigella (16, 35, 9).

1.8. Implicatia speciei Escherichia coli

serotipul O₁₅₇:H₇ in patologie

Prima data acest serotip a fost izolat in 1975 in SUA, de la pacienti care prezentau diaree hemoragica, sugerindu-se ca ar putea fi un germen patogen pentru om, dar abia in 1982 s-a f`cut legatura dintre E.coli O₁₅₇:H₇ si colita hemoragica a pacientilor. Datorita asocierii cu colita hemoragica acest serotip a fost incadrat in grupul E. coli enterohemoragic (EHEC) (29, 10, 5).

Escherichia coli O₁₅₇:H₇ prezinta caracterele morfologice, culturale si biochimice tipice pentru specia Escherichia coli, cu exceptia incapacitatii de a fermenta sorbitolul si de a produce b-D-galactozidaza si b-D-glucuronidaza. Spre deosebire de alte serotipuri E.coli O₁₅₇:H₇ se dezvolta mai discret la suprafata agarului nutritiv, formind colonii mai mici. Pe agarul Mac Conkey cu sorbitol formeaza colonii sorbitol negative, transparente si mult mai mici decit coloniile tulpinilor sorbitol pozitive care sunt mult mai mari si colorate in rosu.

Se dezvolta bine pe medii obisnuite, la temperaturi intre 30 si 42 °C (10). Inactivarea E.coli O₁₅₇:H₇ din carnea de vita, porc sau pui are loc la temperaturi mai mari de 64 °C. Congelata la -20 °C ramine viabila 9 luni (43, 10). Se poate multiplica dar cu o rata redusa la temperatura de refrigerare daca celelalte conditii sunt favorabile.

S-a constatat ca se multiplica in sucul de mere nefermentat (cidru), [n unele salate, sosuri sau maioneze acide. Se poate multiplica pina la un pH minim de 4,5(43, 10, 34).

E.coli O₁₅₇:H₇ a mai fost izolata si din apa, iaurt, lapte nepasteurizat, carne si produse din carne netratate termic (34, 43).

Escherichia coli O₁₅₇:H₇ este responsabila de colita hemoragica, diareea hemoragica, si sindromul hemolitic - uremic (HUS) la om (10, 12, 43, 34).

HUS este o complicatie a colitei hemoragice produsa de EHEC la copii sub 5 ani si persoane in virsta. Este o afectiune renala acuta, insotita de o anemie hemolitica microangiopatica, trombocitopenie, uneori si de semne nervoase.

Tulpinile EHEC sunt frecvente in afectiunile diareice la vitel (39, 10). La porc se intilnesc mai frecvent serotipurile O₁₃₈:K₄₁ , O₁₃₉:K₈₂ , O₁₄₁:K₈₅ , ce sunt cauza aparitiei "bolii edemelor". Aceste tulpini produc o varianta a toxinei VT2 (VT2v) care injectata la purcei reproduce simptomele si leziunile bolii edemelor. Administrarea orala la porc a serotipului O₁₅₇:H₇ reproduce de asemenea semnele bolii edemelor (10).

Indivizii cu colita hemoragica provocata de E.coli O₁₅₇:H₇ nu prezinta febra, ceea ce sugereaza ca serotipul acesta nu este invaziv si nu intra in sistemul circulator. De aici s-a dedus ca bacteria colonizeaza intestinul, elaboreaza toxinele, care apoi actioneaza asupra colonului (10).

Mecanismele de aderenta ale tulpinilor EHEC nu sunt bine cunoscute. La majoritatea tulpinilor s-a demonstrat o aderenta fimbriala cu determinism plasmidic.

EHEC produc leziuni de atasare si distrugere a microvilozitatilor intestinale. Recent s-a identificat gena eae responsabila de sinteza FAE (factorul de atasare - distrugere) (10, 37). Tot gena eae este implicata si in sinteza de intimina (o proteina membranara ce favorizeaza atasarea bacteriei de enterocit) (12).

---

[1] in cazul in care scroafele gestante fusesera anterior vaccinate anti-ETEC