Home Articles

Formula hemocitară (Differential Hemocyte Count – D.H.C.) şi indicele fagocitar în infecţiile bacteriene

experimentale şi în ascosferoza naturală, la albina meliferă (Apis mellifera L.)

în diferite stadii de dezvoltare ontogenetică

I. Sorescu¹, C. Dragomir²

1. S.N. “Institutul Pasteur” S.A. Bucureşti

2. Institutul de Biologie şi Nutriţie Animală - Baloteşti

Cuvinte cheie: Formula hemocitară, Differential Hemocite Count - DHC, indice fagocitar, infecţii bacteriene experimentale, ascosferoză, albina meliferă

Rezumat

S-a calculat şi analizat valoarea procentuală medie, abaterea standard şi coeficientul de variabilitate, DHC (Differential Hemocite Count) la larve, pupe şi albine adulte cu infecţii bacteriene experimentale [Bacillus (Paenibacillus) larvae, E. coli, B. (P.) alvei, B. laterosporus şi B. circulans] şi la cele provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală. Aceasta a permis aprecierea modificării DHC în aceste infecţii sugerarând direcţiile şi sensurile de modificare a proporţiilor populaţiilor de hemocite în principalele boli bacteriene şi micotice ale albinei melifere (loca americană, loca europeană şi ascosferoza).

De asemenea, a fost calculat şi analizat (medie, abatere standard şi coeficient de variabilitate) indicele fagocitar la albine cu infecţii bacteriene experimentale fapt ce a permis aprecierea implicării procesului fagocitar în aceste infecţii.

Introducere

Este cunoscut faptul că, la insecte, infecţiile bacteriene determină modificări ale raportului procentual dintre diferitele tipuri de hemocite din hemolimfă (formulă hemocitară, Differential Hemocite Count - DHC) (15). La albina meliferă (Apis mellifera L.) Van Steenkiste (13) a efectuat infecţii experimentale, la adulte, cu E.coli, Serratia marcescens şi Erwinia carotovora, urmărind supravieţuirea albinelor infectate precum şi capacitatea fagocitară a granulocitelor (GR) cultivate “in vitro”.În condiţii experimentale similare, Casteels et al., 1988 (4), au constatat că fagocitoza nu contribuie la eliminarea celulelor bacteriene din hemolimfă. NU se fac, în ambele lucrări, referiri la DHC. Papadopoulou-Karabela et al., 1983 (10), au determinat modificările DHC la albine adulte infectate experimental cu Pseudomonas aeruginosa. Wille şi Vecchi, 1974 (16), au determinat modificările DHC la adultele cu septicemie, nosemoză şi cu infecţii mixte, dar ei au utilizat o clasificare actualmente depăşită a hemocitelor. Nu am întâlnit, în literatura consultată, alte date privind modificarea DHC la albina meliferă în infecţiile bacteriene. De asemenea, nu am întâlnit date privind analiza DHC în infecţiile micotice ale insectelor, inclusiv ale albinei melifere.

În acest context, calcularea şi analiza DHC (stabilirea valorii procentuale medii, a abaterii standard şi a coeficientului de variabilitate pentru fiecare tip de hemocit din toate loturile şi subloturile de insecte) la larve, pupe şi albine adulte cu infecţii bacteriene experimentale şi la cele provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, ar putea sugera direcţiile şi sensurile de modificare a raporturilor dintre populaţiile de hemocite în principalele boli bacteriene şi micotice ale albinei melifere.

În aceste condiţii, modificarea DHC ar putea constitui cel puţin imaginea unor mecanisme celulare de apărare imună, dacă nu chiar un mecanism în sine, întrucât creşterea proporţiei unor hemocite şi scăderea proporţiei altora permite, în ansamblu, amplificarea exprimării funcţiilor primelor şi menţinerea scăzută a exprimării funcţiilor celor din urmă. Astfel, creşterea proporţiei (valorii procentuale medii) GR+OE [hemocitelor din categoria granulocite + oenocitoide, (12)] poate arăta importanţa fagocitozei funcţie îndeplinită exclusiv de această categorie de hemocite. În acest mod, creşterea proporţiei GR+OE este un mecanism celular de apărare, iar modificarea DHC însumează exprimarea (imaginea) creşterii şi descreşterii procentuale a tuturor tipurilor de hemocite.

În plus, calcularea şi analiza (media, abatere standard şi coeficient de variabilitate) indicelui fagocitar la insectele cu infecţii bacteriene experimentale permite aprecierea implicării procesului fagocitar în aceste infecţii şi, implicit, sugerează gradul de implicare a acestui mecanism în infecţiile bacteriene naturale ale albinei melifere.

Material şi metode

a) Insecte

Au fost utilizate albine (larve pupe, adulte) provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală (lotul II) şi din familii de albine clinic sănătoase aparţinând aceleiaşi stupine (loturile I, III, IV şi V). Modul şi condiţiile de întreţinere şi hrănire ale insectelor în laborator au fost prezentate într-un articol anterior (12).

În privinţa insectelor provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, întrucât larvele şi pupele tinere vizibil afectate de ascosferoză (acoperite cu miceliu) sunt deja moarte (1) am fost nevoiţi să lucrăm cu larve, pupe tinere şi, chiar dacă sunt rezistente la infecţie, cu pupe aflate în stadii mai avansate de dezvoltare, şi cu adulte eclozionate din astfel de pupe, clinic sănătoase, aflate însă în imediata vecinătate a puietului mort. Deci, s-a lucrat cu insecte clinic sănătoase care sunt în mod cert contaminate cu spori de Ascosphaera apis şi la care (aspect valabil mai ales pentru larvele şi pupele tinere) este posibil ca procesul infecţios să se afle în diferite faze (inaparente clinic) de evoluţie. Certitudinea contaminării acestor insecte este dată de faptul că aceleaşi albine adulte manifestă atât comportament igienic [de la vârsta de 1-2 zile (9)] cât şi comportament de îngrijire, de hrănire a larvelor [de la 3 la 12 zile, devenind albine doică (9)]. Astfel, pe de o parte, albinele adulte, prin încercarea lor de a elimina din celulele fagurelui “mumiile” ascosferice (larvele moarte de ascosferoză), se contaminează masiv cu spori de A. apis (pe aparatul bucal, membre, torace, etc.), iar pe de altă parte, prin hrănirea şi îngrijirea larvelor, realizează contaminarea acestora cu spori, pe cale digestivă (2, 3, 6, 8) sau /şi pe cale transcuticulară (7, 8, 14). În tabelul 1 se prezintă numărul de insecte pentru fiecare sublot de vârstă al lotului II, pentru care DHC-ul a putut fi determinat. Lotul I a fost alcătuit din 30 albine adulte, lucrătoare, de iarnă, în vârstă de aproximativ 150 zile. Loturile III, IV, V au fost utilizate pentru infecţiile bacteriene experimentale.

b) Infecţiile bacteriene experimentale

Protocolul de lucru a fost adaptat după Casteels et al. (5). Infecţiile experimentale au fost realizate cu:

- Bacillus (Paenibacillus) larvae FMV 11908, inoculându-se câte 1 μlitru suspensie în PBS de celule vii, de 72 ore (=1,3 x 10⁴ UFC sau 5,2 x 10³ UFC), per insectă;

- B. (P.) larvae FMV 11908, inoculându-se câte 1 μl cultură de 72 ore în BHI – bulion (=4,2 x 10³ UFC) per insectă;

- E. coli 574 INMV Pasteur, inoculându-se câte 1 μl suspensie în PBS de celule vii, de 24 ore (=5 x 10⁴ UFC) per insectă;

- B. (P.) alvei FMV 11909-A, inoculându-se câte 1 μl suspensie în PBS de celule vii, de 24 ore (=1,5 x 10³ UFC sau 5 x 10⁴ UFC), per insectă;

- B. laterosporus FMV 11917-A, inoculându-se câte 1 μl suspensie în PBS de celule vii, de 24 ore (=3,4 x 10³ UFC), per insectă;

- B. circulans FMV 11906-B, inoculându-se câte 1 μl suspensie în PBS de celule vii, de 24 ore (=5 x 10⁴ UFC), per insectă;

De asemenea, un număr de insecte au fost inoculate cu câte 1 μl PBS (tampon fosfat salin, pH 7,2), iar din fiecare lot au fost lăsate neinoculate un număr de insecte martor pentru fiecare stadiu de dezvoltare în parte (cu două excepţii). Structura fiecărui lot în parte, modificată în urma efectuării inoculărilor respective, este redată în tabelele 2 - 4. Pentru Inoculări s-au utilizat seringi Hamilton (Koehn Co., Brea, California) cu capacitate de 10 μl, zonele de inoculare fiind: între segmentele abdominale IV-V lateral (pentru larve), şi între segmentele abdominale V-VI, lateral (pentru pupe şi pentru adulte). Înainte de inoculare, suprafaţa cuticulei afost decontaminată prin tamponare uşoară cu un tampon (băţ de chibrit cu vată) îmbibat cu alcool etilic 75%. Albinele adulte au fost amorţite prin ţinere 15 minute la 4⁰C iar pupele şi mai ales larvele au fost manipulate cu foarte mare atenţie (cu ajutorul unei pense oftalmologice) pentru a nu le produce leziuni. După inoculare, larvele şi pupele au fost puse în plăci Petri şi menţinute la termostat (29-30⁰C) 20-24 ore. Adultele au fost trecute în alte cuşti Foti şi menţinute şi ele la 29-30⁰C 20-24 ore. Insectele martor neinoculate au suportat exact aceleaşi manipulări (condiţii) ca şi cele inoculate cu PBS sau cu bacterii (cu excepţia inoculării).

c) Determinarea şi analiza DHC-ului şi a indicelui fagocitar

După 20-24 ore de la inoculare, se extrage câte o picătură de hemolimfă (eventual, adultele se pot amorţi prin menţinere 10 minute la 4⁰C sau se pot decapita) şi se efectuează frotiurile colorate prin metoda Giemsa adaptată (12). Concomitent, se extrage hemolimfă şi se efectuează frotiuri şi de la insectele lotului II.

În plus, de la aceleaşi insecte se extrage hemolimfa şi pentru investigarea răspunsului imun mediat umoral (se va reveni într-un articol viitor). Alte insecte, cu şi fără infecţie, au fost, de asemenea, prelucrate pentru TEM (12). Frotiurile din hemolimfa albinelor în lotul I au fost realizate anterior, după acelaşi protocol.

Frotiurile colorate Giemsa se examinează, identificându-se hemocitele (12) şi numărându-se în total 100 hemocite per frotiu (excepţie au făcut frotiurile de la albinele din lotul I, unde s-au numărat peste 100 hemocite). “Însumarea” valorilor procentuale ale tipurilor şi categoriilor de hemocite alcătuieşte DHC-ul insectei respective. Deşi Van Steenkiste, 1988 (13), recomandă numărarea a 200 hemocite pentru determinarea DHC-ului, am fost obligaţi să numărăm doar câte 100 celule/frotiu (cu excepţia notată) deoarece sunt foarte puţine frotiurile care ajung la un conţinut de 200 celule. Mai mult decât atât, aproximativ 30% dintre frotiuri am fost nevoiţi să le eliminăm deoarece prezentau mult sub 100 hemocite.

Analiza DHC-ului s-a efectuat pentru fiecare sublot de vârstă şi tip de infecţie în parte, iar în cadrul acestora diferenţiat în funcţie de intensitatea, cel puţin aparentă, a multiplicării bacteriilor în hemolimfă (apreciată, într-un mod aproximativ, prin numărul de bacterii libere în hemolimfă per câmp microscopic al frotiului), stabilind valoarea procentuală medie (v.p.m.) a fiecărui tip / categorie de hemocit, abaterea standard (a.s.), coeficientul de variabilitate (c.v.) şi limitele minimă (min) şi maximă (max) a valorii procentuale.

Întrucât, pentru marea majoritate a subloturilor, numărul de insecte pentru care DHC a putut fi determinat a fost mai mic de 10, iar coeficientul de variabilitate a fost, de regulă, mai mare de 10%, nu au putut fi aplicate teste statistice de analiză a diferenţelor dintre acestea. De aceea, s-au evidenţiat doar modificările v.p.m. a fiecărui tip de hemocit din subloturile cu diferite infecţii (inclusiv inoculare cu PBS şi cele din familia cu ascosferoză) faţă de v.p.m. a hemocitelor subloturilor martor neinoculate din acelaşi lot, pentru diferite stadii de dezvoltare ontogenetică, deci modificările DHC-ului mediu. Pentru ascosferoză, unde nu a existat posibilitatea unui martor propriu lotului comparaţia s-a făcut cu v.p.m. rezultată din însumarea tuturor subloturilor martor neinoculate de aceeaşi vârstă cu subiectul comparaţiei, din celelalte loturi.

Prin examinarea microscopică a frotiurilor din hemolimfa insectelor cu infecţii bacteriene experimentale au putut fi observate şi hemocite fagocitare. Raportul dintre numărul de hemocite fagocitare (surprinse în timpul procesului de fagocitoză) şi numărul total de hemocite examinate (100, în cazul nostru) reprezintă indicele fagocitar (if) (15).

Întrucât GR+OE reprezintă singura categorie de hemocite cu capacitate fagocitară (date nepublicate) [Van Steenkiste, 1988 (13), demonstrând că GR constituie unicul tip fagocitar] am considerat util a determina diferenţiat ceea ce am denumit “indicele fagocitar total” (ift) (numărul de hemocite fagocitare raportat la numărul total de hemocite examinate) şi “indicele fagocitar GR+OE” (ifg) (numărul de GR+OE fagocitare raportat la numărul total de GR+OE), în scopul evidenţierii gradului de implicare a GR+OE în procesul fagocitar. Analiza “ift”-ului şi a “ifg”-ului s-a efectuat pentru fiecare sublot de vârstă şi tip de infecţie în parte, iar în cadrul acestora diferenţiat în funcţie de intensitatea, cel puţin aparentă, a multiplicării bacteriilor în hemolimfă (apreciată, într-un mod aproximativ, prin numărul de bacterii libere în hemolimfă per câmp microscopic al frotiului), stabilind v.p.m. a fiecăruia, a.s., c.v.-ul şi min. şi max. valorilor acestora. S-a evidenţiat variaţia v.p.m. a ift-ului şi ifg-ului la subloturile cu diferite infecţii, cu diferite intensităţi de multiplicare a bacteriilor în hemolimfă şi aflate în diferite stadii de dezvoltare ontogenetică.

Rezultate şi discuţii

Rezultatele analizelor DHC-ului, ift-ului şi ifg-ului efectuate pentru fiecare sublot de vârstă, sex şi tip de infecţie în parte, sunt redate în tabelele 5-12.

În tabelele 13-17 sunt evidenţiate modificările v.p.m. ale fiecărui tip / categorie de hemocit din subloturile cu diferite infecţii (inclusiv cele cu inoculare de PBS şi cele provenite din familia cu ascosferoză) faţă de v.p.m. a hemocitelor subloturilor martor neinoculate din acelaşi lot, pentru diferite stadii de ddezvoltare ontogenetică, deci modificările DHC-ului mediu.

Astfel, în urma inoculării cu PBS s-au constatat următoarele modificări (în condiţiile în care nu s-au făcut determinările acestora şi pentru stadiile de pupă cu ochi bruni şi adult 0-6 zile) (tabel 13): v.p.m. a PL1+PR (plasmatocit rotund + prohemocit), PL2 (plasmatocit intermediar) şi PL4 (plasmatocit fusiform) a scăzut, la adultele de 7-45 de zile, dar destul de puţin; v.p.m. a PL3 (plasmatocit oval) a crescut, la adultele de 7-45 de zile, dar destul de puţin (la larve şi pupe ochi albi şi ochi roz v.p.m. a PL1+PR, PL2, PL3, PL4 pentru aceste subloturi comparate fiind zero); v.p.m. a GR+OE a crescut mult (de aproximativ 4 ori) la adultele de 7-45 zile, la larve, pupe ochi albi şi pupe ochi roz înregistrându-se doar scăderi foarte reduse; v.p.m. a CO (coagulocite) aproape că s-a dublat la larve, a crescut, dar mai puţin, la pupe şi a scăzut la adulte.

Van Steenkiste, 1988 (13), în urma inoculării de tuş de India la albine de vară de vârstă neprecizată, a observat că, la 24 ore post-inoculare, PL1 şi PL3 cresc, PL2 scade nesemnificativ iar GR, CO şi PL4 cresc semnificativ, aceste rezultate fiind apropiate faţă de cele obţinute de noi.

Creşterea v.p.m. a GR+OE şi a CO la subloturile (adulte şi respectiv larve) inoculate cu PBS poate sugera faptul că agresiunea în sine (inocularea) este capabilă să inducă aceste creşteri, probabil ca primă etapă a “pregătirii” organismului pentru posibilele invazii bacteriene care s-ar putea realiza prin leziunea creată de agresiune, având în vedere faptul că aceste tipuri celulare sunt implicate în fagocitoză (GR+OE) şi în formarea de noduli (GR+OE şi CO) (13; se va reveni într-un articol viitor).

În urma inoculării cu B. (P.) larvae F.M.V. 11908 (celule vii suspendate în PBS) [deci, în infecţiile experimentale cu B. (P.) larvae] (tabelul 14) au fost constatate următoarele modificări (în condiţiile absenţei determinării acestora şi pentru stadiul de pupă cu ochi albi) (tabelul 14):

- PL1+PR scade la adulte şi apare la pupe ochi roz;

- PL2 creşte la adultele de 0-6 zile dar scade la adultele de 7-45 zile;

- PL3 creşte la adulte;

- PL4 apare (la martor nu există) la adultele de 0-6 zile dar scade la adultele de 7-45 zile;

- GR+OE creşte puţin la adultele de 0-6 zile şi mai mult la adultele de 7-45 zile;

- CO creşte doar la larve şi scade la restul stadiilor.

Este interesant faptul că PL1+PR (de notat că el nu apare la inocularea pupelor ochi roz cu PBS), PL2, PL3, PL4 şi GR+OE sunt modificate în acelaşi mod ca la subloturile inoculate cu PBS (cu excepţia notată) în timp ce CO sunt modificate la fel pentru larve şi adulte dar diferit (invers) pentru pupe. Această observaţie permite două constatări:

a) în general, în infecţia experimantală cu B.(P.) larvae nu se constată (cu două excepţii) modificările v.p.m. ale hemocitelor diferite de cele înregistrate în inoculările cu PBS, ceea ce înseamnă că supoziţiile emise, în acel context, devin probabile; b) se verifică prezenţa acestor modificări pentru ambele categorii de comparaţii, modificările câştigând în rigurozitate.

Astfel, creşterea GR+OE la adultele de 7-45 zile şi a CO la larve se datorează inoculării în sine, ca agresiune, infecţia experimentală cu B.(P.) larvae nedeterminând nici o modificare suplimentară. Însă, trebuie subliniat faptul că la larve şi la pupe, GR+OE, în mod normal, au valori procentuale de peste 90% astfel încât, pe de o parte, semnificaţia uşoarei creşteri sau scăderi a acestei categorii de hemocite, la aceste stadii, este practic nulă, iar pe de altă parte înseamnă că, în mod natural, larvele şi pupele sunt permanent “pregătite” cu un număr maxim (procentual) de celule capabile de fagocitoză şi de formarea de noduli. La întrebarea “de ce s-a mai investigat, atunci, DHC-ul, la larve şi la pupe cu infecţii?” răspunsul este: a) pentru a fi sigur că, într-adevăr, DHC-ul calculat la martorii neinoculaţi, pe un număr mic de insecte, este unul apropiat de realitate, b) pentru a observa dacă, prin infecţii, nu apar cumva, mai devreme în ontogenie, faţă de martorul neinoculat, diferite tipuri de hemocite [fapt constatat chiar la infecţia cu B.(P.) larvae, PL1+PR nefiind prezent la pupele cu ochi roz martor dar apărând la acest stadiu în urma infecţiei şi nu a inoculării cu PBS] şi c) pentru că, la pupe ochi bruni deja apar şi alte tipuri de hemocite (PR+PL1 şi PL2), posibilităţile de modificare a DHC-ului fiind mai multe.

Nu avem o explicaţie privind semnificaţia apariţiei PL1+PR mai devreme, în ontogenie, la pupe ochi roz, în infecţia experimentală cu B.(P.) larvae. Fapt este că această apariţie pare a fi indusă de infecţia cu B.(P.) larvae şi nu de inoculare. De asemenea, se pare că infecţia a indus şi apariţia PL4 la adulte 0-6 zile.

Creşterea GR+OE la adulte [atât la inocularea cu PBS cât şi la inocularea cu B.(P.) larvae] poate sugera faptul că fagocitoza este importantă în apărarea imună la acest stadiu. Prezenţa numărului foarte mare de GR+OE la larve şi la pupe arată că, la aceste stadii, fagocitoza este, foarte probabil, esenţială, ca mecanism în apărarea împotriva tuturor infecţiilor bacteriene şi micotice. Rămâne ca acest fapt să fie corelat cu rezultatele investigării ift-ului şi a ifg-ului.

În urma inoculării cu B.(P.) alvei F.M.V. 11909-A (tabelul 15) au fost constatate următoarele modificări (în condiţiile nedeterminării acestora pentru larve, pupe ochi albi şi roz şi adulte 0-6 zile) (tabelul 15):

- PL1+PR şi PL2 scad mai mult de jumătate la adultele de 7-45 zile, deci mai mult decât la inocularea cu PBS şi la infecţia cu B.(P.) larvae;

- PL1+PR creşte slab la pupe cu ochi bruni, la fel ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae;

- PL2 creşte foarte puţin la pupe cu ochi bruni, în timp ce la infecţia cu B.(P.) larvae scade foarte puţin;

- PL3 creşte la adultele de 7-45 zile la fel ca şi la inocularea cu PBS şi cu B.(P.) larvae;

- PL4 scade la jumătate, aproape la fel ca la celelalte tipuri de inoculări;

- GR+OE creşte de aproximativ 50 ori la adultele 7-45 zile, deci mai mult decât la celelalte două inoculări;

- CO scade la adultele de 7-45 zile la fel ca şi la celelalte două inoculări şi creşte la pupe ochi bruni, spre deosebire de inocularea cu B.(P.) larvae, unde scădea.

În general se confirmă, şi prin această infecţie experimentală, sensul modificărilor deja constatate pentru primele două inoculări, în unele cazuri chiar prin valori apropiate, deosebirile remarcate la infecţia cu B.(P.) alvei fiind: scăderea accentuată a PL1+PR şi PL2 la adultele de 7-45 zile (semnificaţie necunoscută), creşterea mult mai pronunţată a GR+OE [ceea ce ar putea semnifica o implicare mai intensă a fagocitozei în infecţia experimentală cu B.(P.) alvei decât în cea cu B.(P.) larvae, la adultele de 7-45 zile şi, în plus, probabil, inducerea creşterii GR+OE şi, implicit, a fagocitozei, nu numai prin inoculare ci şi prin infecţia cu B.(P.) alvei în sine] şi creşterea CO la pupe ochi bruni (ar putea semnifica o creştere a capacităţii de formare de noduli].

În urma inoculării cu E. coli 574 Pasteur (tabelul 16) au fost constatate următoarele modificări (în condiţiile nedeterminării acestora pentru pupe ochi roz, bruni şi pentru adultele 0-6 zile) (tabelul 16):

- PL1+PR scade puţin, mai puţin decât la primele trei inoculări, la adult 7-45 zile;

- PL2 scade mai mult decât la primele trei inoculări;

- PL3 creşte, la fel ca la primele trei inoculări;

- PL4 creşte, la adult 7-45 zile, spre deosebire de toate celelalte inoculări, unde a scăzut;

- GR+OE scad la adult 7-45 zile, spre deosebire de toate celelalte inoculări unde a crescut;

- CO a crescut (de aproximativ 16 ori) la adult de 7-45 zile şi a scăzut la larve, adică invers faţă de infecţia cu B.(P.) larvae şi faţă de inocularea cu PBS.

Se observă că, dacă modificările PL1+PR, PL2, PL3 respectă sensul celor de la primele trei inoculări, modificările înregistrate de PL4 (semnificaţie necunoscută), GR+OE [foarte probabil, semnifică neimplicarea procesului fagocitar în infecţia cu E.coli a adultelor de 7-45 zile, supoziţie sprijinită şi de rezultatele cercetărilor lui Casteels et al., 1988 (4), efectuate tot cu E. coli şi albine adulte] şi CO (probabil că, în absenţa creşterii GR+OE, şi implicit în condiţiile neimplicării procesului fagocitar în infecţia cu E. coli, cresc foarte mult CO, care ar contribui la creşterea capacităţii de formare a nodulilor, proces care ar presupune, însă, şi contribuţia GR+OE, dar ar determina şi intensificarea capacităţii de coagulare a hemolimfei) sunt total contrare modificărilor de la inocularea cu PBS şi de la infecţiile experimentale cu B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei. Acest fapt este foarte interesant întrucât: a) demonstrează că infecţia bacteriană poate induce modificări ale DHC-ului contrare, şi, deci, independente de cele induse de inocularea în sine; b) aceste modificări din lotul cu infecţia experimentală cu E.coli sunt chiar induse de infecţia cu E. coli, altfel neputând fi explicate, pe de o parte, diferenţele faţă de modificările lotului cu inoculare cu PBS, pe de altă parte, diferenţele flagrante faţă de propriul sublot martor, neinoculat; c) demonstrează posibilitatea inducerii unor modificări diferite ale DHC-ului în infecţii bacteriene diferite ceea ce, pentru sistemul imun al insectelor, este un fapt remarcabil, sugerându-se, implicit, existenţa unui grad, cel puţin incipient, de selectivitate, de specificitate a (activării) mecanismelor imunităţii mediate celular în infecţiile bacteriene, cu atât mai mult cu cât se constată diferenţe ale modificărilor DHC-ului între E.coli pe de o parte şi B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei pe de altă parte, şi mai puţin între infecţiile acestora din urmă; d) sugerează că, şi în cazul infecţiilor experimentale cu cei doi bacili, este foarte probabil ca modificările înregistrate, dacă sunt evident mai marcate decât cele ale subloturilor inoculate cu PBS, chiar dacă în acelaşi sens, sau, cu atât mai mult, dacă sunt contrare, sau diferite faţă de acestea sau între ele, să fie induse de către infecţiile bacteriene în sine şi, implicit, să fie semnificative (de extrapolat la) şi pentru infecţiile similare naturale.

La subloturile de insecte provenite din familia cu infecţie naturală cu A. apis (tabelul 17) au fost constatate următoarele modificări (în condiţiile nedeterminării acestora pentru pupe ochi roz şi a comparării unei pupe ochi albi de trântor cu pupe ochi albi de lucrătoare martore neinoculate):

- PL1+PR apare la pupe ochi albi (atenţie, e pupă de trântor comparată cu pupe martor de lucrătoare; oricum este puţin probabil ca PL1+PR să existe şi la pupe de trântori neinoculate cu ochi albi întrucât, la pupele ochi roz trântori martori, v.p.m. = 1,33%), creşte foarte puţin la pupe ochi bruni (ca şi la infecţiile cu bacili) şi creşte ceva mai mult la adulte (spre deosebire de toate infecţiile bacteriene şi de inocularea cu PBS);

- PL2 la pupe ochi bruni creşte de aproximativ 4 ori [la infecţiile cu B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei scăzând şi, respectiv, crescând foarte puţin], creşte mai puţin la adultele de 0-6 zile [ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae] şi scade la adultele de 7-45 zile (ca la toate inoculările);

- PL3 creşte puţin la adultele de 0-6 zile [mai puţin decât la infecţia cu B.(P.) larvae] şi scade la jumătate la adultele de 7-45 zile, contrar tuturor inoculărilor;

- PL4 apare la adultele de 0-6 zile (la martor nu există), ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae, şi dispare la adultele de 7-45 zile (existând la martor), contrar tendinţelor de a creşte de la infecţia cu E.coli, şi în consens cu tendinţa de scădere de la celelalte inoculări;

- GR+OE scade la adultele de 0-6 zile, contrar infecţiei cu B.(P.) larvae, şi creşte de aproximativ 36 de ori la adultele de 7-45 zile, în consens cu toate inoculările, cu excepţia celei cu E.coli;

- CO cresc la larvae, în consens cu toate inoculările, cu excepţia celei cu E.coli, scade la pupe ochi albi (trântor), invers faţă de modificarea de la inocularea cu PBS şi cu E.coli, creşte la pupe ochi bruni, ca şi la inocularea cu B.(P.) alvei dar contrar inoculării cu B.(P.) larvae, scade la adultele de 0-6 zile, ca şi la inocularea cu B.(P.) larvae şi creşte la adultele de 7-45 zile, mai puţin decât la inocularea cu E.coli dar contrar tuturor celorlalte inoculări.

Modificările importante, şi manifestate faţă de toate inoculările, sunt: apariţia PL1+PR la pupe ochi albi (înregistrată la pupa de trântor), creşterea PL1+PR la adulte, creşterea PL2 la pupele ochi bruni, scăderea PL3 la adultele 7-45 zile.

Faptul că s-au înregistrat modificări ale PL1+PR, PL2 şi PL3 diferite (contrare) faţă de toate celelalte inoculări (bacteriene şi cu PBS), sugerează posibilitatea ca aceste modificări să fie caracteristice insectelor provenite din familia cu infecţie naturală cu A. apis şi, implicit, ca ele (modificările) să fie induse (relativ specific) de infecţia inaparentă clinic cu acest fung. Semnificaţia apariţiei PL1+PR la pupe ochi albi, a creşterii acestor hemocite la adulte, a creşterii PL2 la pupele ochi bruni şi a scăderii PL3 la adultele de 7-45 zile ne este necunoscută, chiar şi la nivel ipotetic [totuşi, nu este exclus să semnifice activarea procesului de încapsulare în care, probabil, sunt implicate aceste celule – se va reveni într-un capitol viitor). Bineînţeles că şi celelalte modificări, ale celorlalte tipuri de hemocite, sunt probabil induse tot de infecţia inaparentă clinic cu A. apis dar, fiind comune (relativ) cu modificările induse de inoculările bacteriene, sunt categoric necaracteristice ascosferozei,

În tabelele 18 şi 19 sunt evidenţiate variaţiile valorilor medii ale ift-ului şi ifg-ului la subloturile cu diferite infecţii, cu diferite intensităţi de multiplicare a bacteriilor în hemolimfă şi aflate în diferite stadii de dezvoltare ontogenetică.

În condiţiile nedeterminărilor pentru unele infecţii şi unele vârste, s-a constatat că:

- cu cât numărul de bacterii libere în hemolimfă este mai mare, cu atât ift-ul şi ifg-ul sunt mai mari şi invers;

- la acelaşi număr (aproximativ) de bacterii libere, de aceeaşi specie [B.(P.) larvae] în hemolimfă, ift a fost maxim la larve şi a scăzut treptat odată cu avansarea în vârstă, fiind minim la adultele de 7-45 zile. Aceiaşi constatare şi pentru infecţia cu B.(P.) alvei şi cu E. coli a (0-5 bacterii libere în hemolimfă per câmp microscopic). Ifg a variat la fel pentru infecţia cu B.(P.) alvei şi cea cu B.(P.) larvae a (0-10 bacterii libere) dar a variat invers pentru infecţia cu B.(P.) larvae b (11-80 bacterii libere), având valoare mai mare la adulte 7-45 zile şi mai mică la adulte 0-6 zile, şi nu a variat pentru infecţia cu E.coli b (40-200 bacterii libere) între larve şi pupe (ca şi ift-ul pentru E.coli b);

- ift-ul cel mai mare s-a înregistrat în infecţia cu E. coli, urmată de infecţia cu B. (P.) alvei, la pupe ochi albi şi, respectiv, la pupe ochi bruni;

- ifg-ul cel mai mare s-a înregistrat în infecţia cu B. (P.) larvae, urmată de infecţia cu E. coli, la adulte şi, respectiv, la larve şi pupe ochi albi;

Astfel, se pare că if este, mai curând, funcţie de intensitatea infecţiei (a multiplicării bacteriene în hemolimfă) decât un indiciu pozitiv al eficienţei fagocitozei în apărarea împotriva infecţiei. Am constatat următoarele relaţii:

a) ifg redus, numărul bacteriilor libere tinde către 0 => infecţie redusă şi eficienţă ridicată a fagocitozei;

b) ifg crescut, numărul bacteriilor libere crescut => infecţie puternică şi eficienţă redusă a fagocitozei;

În infecţia cu B. (P.) larvae, la larve, ift este aproximativ 0,29 la un număr de 0-10 bacili liberi / câmp frotiu, ceea ce poate însemna o infecţie medie, cu un ift mediu, în timp ce, la pupe şi cu atât mai mult la adulte, ift scade sub 0,1. La adulte este mai semnificativ ifg întrucât numărul de GR+OE este mult mai mic decât la stadiile preimaginale. Astfel, la adulte de 7-45 zile, la 11-80 bacterii libere se constată ift 0,043 şi ifg 0,93, ceea ce demonstrează că GR+OE sunt aproape 100% fagocitare în această infecţie la acest stadiu, la acest număr de bacterii libere. Deci, în infecţiile reduse fagocitoza pare să fie eficientă însă, când numărul de bacterii libere în hemolimfă depăşeşte câteva zeci / câmp, fagocitoza devine ineficientă, în ciuda mobilizării a aproape întregului număr de GR+OE. Ca mecanism de apărare, fagocitoza este intens implicată în infecţia experimentală şi foarte probabil, şi în infecţia naturală cu B.(P.) larvae.

În infecţia experimentală cu B.(P.) alvei la pupe ochi bruni şi adulte 7-45 zile, s-au constatat 15-50 bacili liberi / câmp la pupe, un ift = 0,42 şi un ifg = 0,49, şi 0-10 bacili la adulte, cu ift = 0,01 şi ifg = 0,04, ceea ce sugerează o implicare intensă a fagocitozei în infecţia experimentală şi, foarte probabil şi în infecţia naturală cu B.(P.) alvei, mai ales la pupe unde, însă, mecanismul devine ineficient. La adulte probabil că mecanismul este mai eficient, nefiind însă exclusă intervenţia, în paralel, şi a altor mecanisme de apărare. Deci, probabil că şi în infecţia cu B.(P.) alvei, fagocitoza este eficientă numai când numărul de bacili liberi în hemolimfă este mic.

Şi în infecţia experimentală cu Escherichia coli s-a constatat o implicare intensă a fagocitozei (ift = 0,58, ifg = 0,62 pentru larve) dar şi totala ineficienţă a acesteia la larve şi pupe, existând şi câmpuri cu câte 200 bacterii la pupele ochi albi.

Deşi aceste infecţii experimentale au fost realizate prin inoculare transcuticulară în hemocel, considerăm că toate rezultatele obţinute sunt semnificative şi pentru infecţiile naturale (realizate obişnuit, pe cale digestivă) deoarece, de exemplu, B.(P.) larvae are capacitatea de a depăşi, la larvele de 3-5 zile, bariera intestinală (11) ajungând în hemolimfă, unde se multiplică intens, determinând septicemie (3, 11). Noi am introdus în hemocel exact forma vegetativă a lui B.(P.) larvae, simulând astfel situaţia din natură, cel puţin pentru larve, astfel încât, în mod sigur, conflictul între mecanismele de virulenţă ale bacteriei şi mecanismele de apărare ale insectei are loc în hemolimfă. În plus, această cale, transcuticulară, de administrare a dozelor bacteriene, este singura care oferă siguranţa realizării acesteia, a inoculării unei doze exacte, a intervalului de timp efectiv a infecţiei, etc.

Concluzii

A fost realizată analiza (v.p.m., a.s., c.v., min. şi max.) DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului larvelor, pupelor de diferite stadii şi albibnelor adulte de diferite vârste cu infecţii bacteriene experimentale şi a celor provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală. S-a constatat că agresiunea în sine (inocularea) este capabilă să inducă creşteri ale GR+OE la adultele de 7-45 zile şi ale CO la larve, că infecţia cu B.(P.) larvae poate induce apariţia la adultele de 0-6 zile a PL4 şi a PL1+PR la pupele cu ochi roz, că infecţia cu B.(P.) alvei poate induce o creştere pronunţată a GR+OE la adultele de 7-45 zile, că infecţia cu E.coli induce modificări ale PL4, GR+OE şi CO, contrare faţă de cele induse de inocularea cu PBS, B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei şi că, la subloturile de insecte provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, modificările PL1+PR, PL2 şi PL3 sunt contrare modificărilor acestor hemocite din subloturile cu infecţii bacteriene şi inoculare cu PBS. Astfel, s-a evidenţiat implicarea profundă a GR+OE, sugerându-se implicit implicarea fagocitozei în aceste infecţii bacteriene experimentale cu excepţia celei cu E. coli, şi probabil în infecţia clinic inaparentă a insectelor cu A. apis, precum şi implicarea într-un mod necunoscut a PL4 în infecţia cu E.coli şi a PL1+PR şi PL2 în infecţia cu A. apis.

S-a constatat că, cu cât numărul de bacterii libere în hemolimfă este mai mare, cu atât ift-ul şi ifg-ul sunt mai mari şi, implicit, infecţia este mai intensă şi eficienţa fagocitozei este mai redusă. Astfel, în infecţiile bacteriene experimentale cu B.(P.) larvae, B.(P.) alvei şi E.coli, fagocitoza este intens implicată însă ea pare a fi eficientă numai când numărul de bacterii libere / câmp frotiu este mic. Când acest număr depăşeşte câteva zeci, fagocitoza pare a deveni ineficientă.

Considerăm că aceste rezultate pot fi semnificative şi pentru infecţiile bacteriene naturale, cel puţin pentru larve şi pupe ochi albi şi roz.

Mulţumiri d-lui Ing. Stancu G. pentru amabilitatea deosebită de a le pune la dispoziţie albinele (diferite stadii de dezvoltare ontogenetică) provenite din familii sănătoase.

Bibliografie

1. Alonso J.M., Rey J., Puerta F., de Mendoza J.H., de Mendoza M.H., Flores J.M., 1993. Enzymatic equipment of Ascosphaera apis and the development of infection by this fungus in Apis mellifera. Apidologie, 24 (4), 383-391

2. Bailey L., 1963. Infectious diseases of the honey-bee. Land Books Limited, London.

3. Bailey L., 1981. Patologia albinelor. Buletinul de Informare Stiintifica nr. 7, 1993, LCSVD, Bucuresti. Traducere si prelucrare Dr. Mardare Aneta si Biol. Chioveanu Gabriela, dupa: Bailey L. (1981), Honeybee Pathology, Academic Press, London

4. Casteels P.R., Van Steenkiste D., Jacobs F.J., 1988. The antibacterial response of haemolymph from adult honeybees (Apis mellifera L.) in relation to secondary infections. In: Proc. Meeting E.C. Experts Group: European Research on Varroatosis Control. Bad Hamburg, 105-111

5. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Vaeck M., Tempst P., 1989. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees. The EMBO Journal, 8, (8), 2387-2391

6. Gilliam Martha, 1978. Fungi. In: Roger A. Morse (Ed), Honey bee pests, predators and diseases. Cornell University Press, Ithaca and London, 78-101

7. Gilliam Martha, 1978. Chalkbrood – Status today and hopes for control. American Bee Journal, 118 (7), 468-471

8. Gilliam Martha, Taber S. III, Rose J.B., 1978. Chalkbrood disease of honey bees, Apis mellifera L.: a progress report. Apidologie, 9 (1), 75-89

9. Mârza E., Nicolaide N., 1990. Initiere si practica în apicultura. Editura de propaganda tehnica agricola, Bucuresti, p. 44

10. Papadopoulou Karabela K., Iliadis N., Liakos V., 1993. Haemocytes changes in honeybee (Apis mellifera L.) artificially infected by Pseudomonas aeruginosa. Apidologie, 24, 81-86

11. Popa Al., 1965. Bolile albinelor si viermilor de matase. Editura Agro-Silvica, Bucuresti, 34-35

12. Sorescu I., Turcu D., 1998. Contribuţii privind hemocitele albinei melifere (Apis mellifera L.): caractere morfologice şi clasificare, multiplicare şi răspândire în organism. Studii şi Cercetări de Medicină Veterinară (Institutul Pasteur), 7

13. Van Steenkiste D., 1988. De hemocyten van de honingbij (Apis mellifera L.): typologie, bloedbeeld en cellulaire verdedigingsreacties. Doctoraatsproefschrift, Rijksuniversiteit Gent, Belgium

14. Vey A., 1990. Recent researches on ascosphaerosis. In: Proc. Int. Sym. Recent Res. Bee Pathology (Ritter W. ed.), Apimondia, Ghent, Belgium, 40-143

15. Whitcomb R.F., Shapiro M., Granados R., 1974. Insect defense mechanisms against microorganisms and parasitoids. In: The physiology of Insecta, second edition, edited by Rockstein M., vol. V, Academic Press, New York and London, 447-536

16. Wille H., Vecchi Maria A., 1974. Untersuchungen uber die Hamolymphe der Honigbiene (Apis mellifica L.). Mitteilungen der Schweizerischen Entomologischen Gesellschaft, 47, 133-149

Tabelul 1. Numărul de insecte, pentru fiecare sublot de vârstă al lotului II, pentru care DHC-ul a putut fi determinat

Larve lucr. 5-7 zile	Larve trântor. 5-7 zile	Pupe ochi albi trântori	Pupe ochi bruni lucr.	Pupe ochi bruni trântori.	Pupe ochi bruni şi torace pigm.-ecloz lucrătoare	Adulte lucr vară. 0-6 zile	Adulte lucr vară. 7-45 zile
11	3	1	9	4	7	7	2

Tabelul 2. Structura lotului III de insecte, în urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

	Larve lucrăt. 5-7 zile	Pupe ochi albi lucrăt.	Pupe ochi roz lucrăt.	Pupe ochi roz trântor.	Pupe ochi bruni trântori	Adulte lucr vară. 7-45 zile
Martor neinoculat	4	5	5	3	-	4
Martor inoculat cu PBS	3	3	8	-	-	2
B(P.) larvae PBS	-	-	10	-	-	4
B(P.) larvae bulion	-	-	-	-	5	-
E. coli	7	6	-	-	-	2

(“-“: nu s-a lucrat)

Tabelul 3. Structura lotului IV de albine, în urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

	Martor neinoculat	Martor inoculat cu PBS	B.(P.) larvae PBS	B.(P.) larvae bulion
Adulte lucr. de vară, 7-45 zile	6	3	4	3

Tabelul 4. Structura lotului V de insecte, în urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

	Larve lucrăt. 5-7 zile	Pupe ochi bruni lucrăt.	Adulte lucrăt. vară. 0-6 zile	Adulte lucrăt. vară. 7-45 zile
Martor neinoculat	8	6	4	-
B.(P.) larvae PBS	7	7	10	-
B.(P.) alvei	-	14	-	3
B. laterosporus	-	8	-	-
B. circulans	-	12	-	-

(“-“: nu s-a lucrat)

Tabelul 5. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de larve [M.n. = martor neinoculat; L = lucrătoare; tr = trântori; Asc = ascosferoză; M PBS = martor inoculat cu PBS; N = număr de insecte, valori; a.s. = abaterea standard; c.v. = coeficient de variabilitate; min = valoare minimă; max = valoare maximă;
“-“ = nu e cazul sau nu are sens; II-V = loturile de insecte; a = 0-25 celule de B. (P.) larvae libere în hemolimfă / câmp frotiu; b = 40-100 celule de E. coli libere în hemolimfă / câmp frotiu); PL1+PR = plasmatocit rotund+prohemocit; PL2 = plasmatocit intermediar; PL3 = plasmatocit oval; PL4 = plasmatocit fusiform; GR+OE = granulocit + oenocitoid; CO = coagulocit

Nr.crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Elementele analizei	V Larve M.n. (L)	III Larve M.n. (L)	V Larve B.(P.) larvae PBS (L) a	III Larve E. coli (L) b	II Larve Asc. (tr)	II Larve Asc. (L)	III Larve M.PBS. (L)
1	PL1+PR	N	8	4	7	7	3	11	3
		medie	0	0	0	0	0	0	0
		a.s.	0	0	0	0	0	0	0
		cv%	-	-	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	0	0	0
		max	0	0	0	0	0	0	0
2	PL2	idem	PL1+PR
3	PL3	idem	PL1+PR
4	PL4	idem	PL1+PR
5	GR+OE	N	8	4	7	7	3	11	3
		medie	98,88	90,25	95,71	94,14	95,67	92,18	82
		a.s.	0,83	5,3	4,5	5,15	3,51	3,57	2
		cv%	1	6	5	5	4	4	2
		min	98	84	90	85	92	86	80
		max	100	97	100	100	99	96	84
6	CO	N	8	4	7	7	3	11	3
		medie	1,12	9,75	4,29	5,86	4,33	7,82	18
		a.s.	0,83	5,3	4,5	5,15	3,51	3,57	2
		cv%	74	55	105	88	81	46	11
		min	0	3	0	0	1	4	16
		max	2	16	10	15	8	14	20
7	ift	N	-	-	7	7	-	-	-
		medie			0,286	0,58
		a.s.			0,13	0,15
		cv%			47%	26%
		min			0,1	0,29
		max			0,5	0,72
8	ifg	N	-	-	7	7	-	-	-
		medie			0,30	0,62
		a.s.			0,15	0,17
		cv%			49%	27%
		min			0,1	0,29
		max			0,56	0,77

Tabelul 6. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de pupe cu ochi albi (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar cu următoarele modificări: a = 0-1 celule de E. coli libere în hemolimfă / câmp frotiu; b = 100-200 celule de E. coli libere în hemolimfă / câmp frotiu)

Nr.crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Elementele analizei	III Pupe ochi albi M.n. (L)	III Pupe ochi albi M.PBS. (L)	III Pupe ochi albi E. coli (L) a	III Pupe ochi albi E. coli (L) b	II Pupe ochi albi Asc. (tr)
1	PL1+PR	N	5	3	4	2	1
		medie	0	0	0	0	1
		a.s.	0	0	0	0	-
		cv%	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	1
		max	0	0	0	0	1
2	PL2	N	5	3	4	2	1
		medie	0	0	0	0	0
		a.s.	0	0	0	0	-
		cv%	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	0
		max	0	0	0	0	0
3	PL3	idem	PL2
4	PL4	idem	PL2
5	GR+OE	N	5	3	4	2	1
		medie	93,6	92	93,75	93	98
		a.s.	6,43	2,65	1,89	1,41	-
		cv%	7	3	2	2	-
		min	84	90	91	92	98
		max	100	95	95	94	98
6	CO	N	5	3	4	2	1
		medie	6,4	8	6,25	7	1
		a.s.	6,43	2,65	1,89	1,41	-
		cv%	100	33	30	20	-
		min	0	5	5	6	1
		max	16	10	9	8	1
7	ift	N	-	-	4	2	-
		medie			0,088	0,575
		a.s.			0,025	0,035
		cv%			29	6
		min			0,05	0,55
		max			0,1	0,6
8	ifg	N	-	-	4	2	-
		medie			0,098	0,62
		a.s.			0,025	0,028
		cv%			26	5
		min			0,06	0,6
		max			0,11	0,64

Tabelul 7. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de pupe cu ochi roz [aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar cu modificările: a = 0-1 celule de B.(P.) larvae libere în hemolimfă / câmp frotiu, şi b nu există]

Nr.crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Ele men tele analizei	III Pupe ochi roz M.n. (L)	III Pupe ochi roz M.n. (tr)	III Pupe ochi roz M.PBS. (L)	III Pupe ochi roz B.(P) larvae. PBS. (L) a
1	PL1+PR	N	5	3	8	10
		medie	0	1,33	0	0,1
		a.s.	0	1,16	0	0,32
		cv%	-	87	-	316
		min	0	0	0	0
		max	0	2	0	1
2	PL2	N	5	3	8	10
		medie	0	0,33	0	0
		a.s.	0	0,57	0	0
		cv%	-	173	-	-
		min	0	0	0	0
		max	0	1	0	0
3	PL3	N	5	3	8	10
		medie	0	0	0	0
		a.s.	0	0	0	0
		cv%	-	-	-	-
		min	0	0	0	0
		max	0	0	0	0
4	PL4	idem	PL3
5	GR+OE	N	5	3	8	10
		medie	92,8	94	89,37	93,6
		a.s.	8,2	7	6,95	4,4
		cv%	9	7	8	5
		min	84	86	77	86
		max	100	99	95	99
6	CO	N	5	3	8	10
		medie	7,2	4,34	10,63	6,3
		a.s.	8,2	6,66	6,95	4,22
		cv%	114	154	65	67
		min	0	0	5	1
		max	16	12	23	13
7	ift	N	-	-	-	10
		medie				0,08
		a.s.				0,026
		cv%				32
		min				0,05
		max				0,1
8	ifg	N	-	-	-	10
		medie				0,086
		a.s.				0,027
		cv%				32
		min				0,05
		max				0,11

Tabelul 8. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru 7 subloturi de pupe cu ochi bruni (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar fără “a”, iar b = bacili liberi în hemolimfă / câmp frotiu)

Nr. crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Ele men tele analizei	V Pupe ochi bruni M.n. (L)	V Pupe ochi bruni B.circulans (L)0-1b	V Pupe ochi bruni B.circulans (L)0-10b	V Pupe ochi bruni B.circulans (L)20-100b	V Pupe ochi bruni B. laterosporus (L)0-8b	V Pupe ochi bruni B. laterosporus (L) 20-60b	V Pupe ochi bruni B. laterosporus (L)100-150b
1	PL1+PR	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	2,83	40	10	9,89	10	4	0
		a.s.	2,23	28,28	-	9,61	-	6,32	-
		cv%	79	71	-	108	-	158	-
		min	0	20	10	0	10	0	0
		max	6	60	10	30	10	14	0
2	PL2	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	0,83	5	0	1,11	5	0	0
		a.s.	0,98	7,07	-	2,42	-	0	-
		cv%	118	141	-	218	-	-	-
		min	0	0	0	0	5	0	0
		max	2	10	0	7	5	0	0
3	PL3	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	0	0	0	0	10	0	0
		a.s.	0	0	-	0	-	0	-
		cv%	-	-	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	10	0	0
		max	0	0	0	0	10	0	0
4	PL4	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	0	0	0	0	0	0	0
		a.s.	0	0	-	0	-	0	-
		cv%	-	-	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	0	0	0
		max	0	0	0	0	0	0	0
5	GR+OE	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	89,84	55	90	86,67	75	91	95
		a.s.	2,64	35,36	-	11,63	-	9,17	-
		cv%	3	64	-	13	-	10	-
		min	86	30	90	63	75	75	95
		max	93	80	90	100	75	100	95
6	CO	N	6	2	1	9	1	6	1
		medie	6,5	0	0	3,33	0	5	5
		a.s.	1,52	0	-	4,39	-	5,51	-
		cv%	23	-	-	132	-	110	-
		min	4	0	0	0	0	0	5
		max	8	0	0	10	0	11	5
7	ift	N	-	2	1	9	1	6	1
		medie		0,06	0,2	0,51	0	0,42	0,8
		a.s.		0,06	-	0,20	-	0,19	-
		cv%		94	-	40	-	47	-
		min		0,02	0,2	0,3	0	0,2	0,8
		max		0,1	0,2	0,71	0	0,7	0,8
8	ifg	N	-	2	1	9	1	6	1
		medie		0,1	0,22	0,59	0	0,44	0,84
		a.s.		0,4	-	0,22	-	0,17	-
		cv%		42	-	37	-	38	-
		min		0,07	0,22	0,3	0	0,27	0,84
		max		0,13	0,22	0,8	0	0,7	0,84

Tabelul 9. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru alte 6 subloturi (+ repetarea prezentării sublotului martor) de pupe cu ochi bruni [aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar a=0-1 celule de B.(P.) larvae libere în hemolimfă / câmp frotiu şi b = bacili liberi în hemolimfă / câmp frotiu]

Nr. crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Ele men tele analizei	V Pupe ochi bruni M.n. (L)	V Pupe ochi bruni B.circ. (L)0-1b	V Pupe ochi bruni B.circ. (L)0-10b	III Pupe ochi bruni B.circ. (L) 20-100b	II Pupe ochi bruni B.later(L) 0-8b	II Pupe ochi bruni B.later(L) 20-60b	II Pupe ochi bruni B.later(L) 100-150b
1	PL1+PR	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	2,83	4,71	3,57	23,4	1,25	3,11	65,43
		a.s.	2,23	5,3	3,95	7,67	1,89	3,14	18,47
		cv%	79	112	111	33	151	101	28
		min	0	0	0	10	0	0	29
		max	6	15	10	28	4	8	88
2	PL2	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	0,83	1,07	0,71	7,6	0,25	3,22	1,57
		a.s.	0,98	2,43	0,95	5,59	0,5	8,27	3,73
		cv%	118	227	133	74	200	257	238
		min	0	0	0	0	0	0	0
		max	2	8	2	15	1	25	10
3	PL3	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	0	0	0	1,6	0,25	0	0
		a.s.	0	0	0	1,14	0,5	0	0
		cv%	-	-	-	71	200	-	-
		min	0	0	0	0	0	0	0
		max	0	0	0	3	1	0	0
4	PL4	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	0	0	0	0	0	0	0
		a.s.	0	0	0	0	0	0	0
		cv%	-	-	-	-	-	-	-
		min	0	0	0	0	0	0	0
		max	0	0	0	0	0	0	0
5	GR+OE	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	89,84	85	90,15	57,8	86,5	83	31,14
		a.s.	2,64	5,86	3,34	13,33	10,47	11,3	18,73
		cv%	3	7	4	23	12	14	60
		min	86	75	85	45	77	64	12
		max	93	93	95	80	97	98	68
6	CO	N	6	14	7	5	4	9	7
		medie	6,5	9,22	5,57	9,6	11,75	10,67	1,86
		a.s.	1,52	3,58	3,91	0,55	8,5	7,09	1,34
		cv%	23	39	70	6	72	66	72
		min	4	2	0	9	3	0	0
		max	8	15	10	10	20	22	4
7	ift	N	-	14	7	5	-	-	-
		medie		0,42	0,07	0,15
		a.s.		0,13	0,04	0,061
		cv%		32	55	41
		min		0,15	0	0,1
		max		0,6	0,1	0,25
8	ifg	N	-	14	7	5	-	-	-
		medie		0,49	0,08	0,27
		a.s.		0,14	0,05	0,12
		cv%		28	56	44
		min		0,2	0	0,13
		max		0,68	0,12	0,45

Tabelul 10. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de albine adulte de vară în vârstă de 0-6 zile şi pentru lotul I de albine adulte de iarnă [legenda este aceeaşi cu cea de la tabelul 5, dar cu următoarele modificări: a = 0-10 celule de B.(P.) larvae libere în hemolimfă / câmp frotiu şi b = 11-60 celule de B.(P.) larvae libere în hemolimfă / câmp frotiu]

Nr. crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Ele men tele analizei	I Adulte iarnă M.nein. (150 z) (L)	V Adulte vară 0-6 zile M.nein. (L)	V Adulte vară 0-6 zile B.(P.) larvae (L) a	V Adulte vară 0-6 zile B.(P.) larvae (L) b	II Adulte vară 0-6 zile Asc (L)
1	PL1+PR	N	7	4	9	1	7
		medie	4,61	69,25	55	24	73,68
		a.s.	3,41	17,29	12,14	-	10,13
		cv%	74	25	22	-	14
		min	0,84	51	33	24	59
		max	8,7	85	71	24	85
2	PL2	N	7	4	9	1	7
		medie	6,68	3,5	9,78	5	6,16
		a.s.	5,85	1,29	3,99	-	5,33
		cv%	88	37	41	-	86
		min	0,28	2	5	5	0,8
		max	17	5	16	5	15
3	PL3	N	7	4	9	1	7
		medie	85,07	9,25	18	10	10,36
		a.s.	10	7,27	7,95	-	4,51
		cv%	12	79	44	-	44
		min	67	2	10	10	5
		max	97,76	16	34	10	16
4	PL4	N	7	4	9	1	7
		medie	1	0	0,33	0	0,89
		a.s.	0,66	0	0,5	-	1,43
		cv%	66	-	150	-	161
		min	0,4	0	0	0	0
		max	2	0	1	0	4
5	GR+OE	N	7	4	9	1	7
		medie	1,22	16	16,22	60	7,91
		a.s.	0,77	9,83	5,89	-	8,37
		cv%	63	61	36	-	106
		min	0	7	9	60	2
		max	2	28	25	60	22
6	CO	N	7	4	9	1	7
		medie	1,42	2	0,67	1	1
		a.s.	2,12	0	0,87	-	1,53
		cv%	149	0	130	-	153
		min	0	2	0	1	0
		max	6	2	2	1	4
7	ift	N	-	-	9	1	-
		medie			0,02	0,05
		a.s.			0,02	-
		cv%			78	-
		min			0	0,05
		max			0,05	0,05
8	ifg	N	-	-	9	1	-
		medie			0,12	0,83
		a.s.			0,1	-
		cv%			84	-
		min			0	0,83
		max			0,33	0,83

Tabelul 11. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru 7 subloturi de albine adulte de vară în vârstă de 7-45 zile (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar: a = 0-5 celule de E. coli libere în hemolimfă / câmp frotiu şi b = bacili liberi în hemolimfă / câmp frotiu)

Nr. crt.	Tip/categ. hemocit, ift,ifg	Ele men tele analizei	III Adulte vară 7-45 zile M.n. (L)	IV Adulte vară 7-45 zile M.n. (L)	III Adulte vară 7-45 zile M.PBS. (L)	IV Adulte vară 7-45 zile M.PBS. (L)	V Adulte vară 7-45 zile B.alvei (L)0-10b	III Adulte vară 7-45 zile E.coli (L)a	II Adulte vară 7-45 zile Asc (L)a
1	PL1+PR	N	4	5	2	3	3	2	2
		medie	37,3	50,2	24,5	45	20	36	53
		a.s.	10,1	9,25	6,4	0	13	19,8	29,7
		cv%	27	18	26	0	65	55	56
		min	27	37	20	45	12	22	32
		max	48	55	29	45	35	50	74
2	PL2	N	4	5	2	3	3	2	2
		medie	25,5	11,4	20	7,3	6,67	11,5	9,5
		a.s.	11,44	5,64	0	4	1,53	9,19	2,12
		cv%	45	49	0	55	23	80	22
		min	10