Cuvinte cheie: hemocite, cultivare “in vitro”, larve de albină meliferă

Rezumat. S-a urmărit obţinerea de culturi primare de hemocite ale albinei melifere, Apis mellifera L., şi
evaluarea unor parametri şi a condiţiilor de cultivare. S-a lucrat cu hemolimfă extrasă de la larve de diferite
vârste (4 – 7 zile) de albină lucrătoare. Caracterizarea morfologică a fost făcută prin examenul direct cu
microscop optic ranversat şi prin coloraţia Giemsa, iar viabilitatea hemocitelor a fost evaluată procentual prin
tehnica de excludere vitală cu o soluţie 0,5% trypan blue. Examinările au fost efectuate din două în două zile,
începând cu a 5-a zi de cultură până la 14 zile, pentru culturile obţinute de la larve în vârstă de 4 – 5 zile şi la 14,
18 şi 21 zile de cultivare pentru culturile obţinute de la larve în vârstă de 6 – 7 zile. Au fost caracterizate
morfologic şi identificate atât hemocitele (granulocite + oenocitoide) cât şi celulele din fragmentele de corp
gras (celule grase şi oenocite) şi a fost apreciată viabilitatea granulocitelor + oenocitoide pentru intervalul 5 –
21 zile de menţinere a celulelor în cultură.


Introducere. Există un număr foarte redus de lucrări privind cultivarea “in vitro” a celulelor şi ţesuturilor de albină
meliferă, Apis mellifera L. În 1968, Stanley (5) şi în 1971, Giauffret (1), au comunicat obţinerea de culturi
primare de ţesut ovarian de pupe de regină pentru ca, în 1988, van Steenkiste (7) să comunice obţinerea de
culturi primare de hemocite.
Cultivarea “in vitro” a hemocitelor este utilă pentru studiul mecanismelor celulare ale imunităţii albinelor (7). În
acest sens, mai întâi trebuie apreciată posibilitatea de a obţine culturi primare de hemocite, apoi de stabilit
parametrii şi condiţiile de supravieţuire a hemocitelor în cultură, urmate de încercări de stabilizare a culturii
primare (deci obţinerea unei linii hemocitare) pentru ca, astfel, să se creeze un important mijloc de studiu atât
al fagocitozei şi formării de noduli cât şi a inducerii sintezei proteinelor imune.
În acest scop, s-a urmărit obţinerea de culturi primare de hemocite şi evaluarea unor parametri (morfologie,
densitate, viabilitate, prezenţa altor tipuri celulare) şi a condiţiilor de cultivare.

Materialşi metodă
a) Insecte
Dintr-o familie sănătoasă de albine au fost recoltate fragmente de fagure cu larve de lucrătoare de diferite
vârste (lotul VI). În aceiaşi zi a fost prelucrată o parte din larvele în vârstă de 4-5 zile (L4-5). Celelalte fragmente
de fagure au fost menţinute 48 h la 300C, prelucrându-se larvele ajunse la vârsta de 6-7 zile (L6-7).
b) Cultivarea “in vitro” a hemocitelor
Protocolul de lucru este o adaptare după Van Steenkiste (7), şi Giauffret (1). Larvele au fost decontaminate prin
imersie 1 minut în alcool etilic 70% şi într-o soluţie de antibiotice(Penicilină 500 UI/ml, Streptomicină 500 g/ml
şi Amfotericină B 2,5 ug/ml) în MEM (Eagle) (Gibco-BRL) 30 secunde şi uscate pe hârtie de filtru. Extragerea
hemolimfei s-a făcut cu pipete Pasteur din vasul dorsal, dintre segmentele abdominale VIII-IX, unde diametrul
vasului este maxim (Nelson, 1924, citat de 1).
Culturile au fost efectuate în plăci de plastic LINBRO (Flow Laboratories) cu 24 godeuri. În fiecare godeu s-au
repartizat câte 300 ul mediu Grace (Sigma) pH 6,5 suplimentat cu 4% hidrolizat de lactalbumină (Sigma), 5%
ser fetal bovin (Sigma) şi antibiotice (Penicilină 50 UI/ml şi Streptomicină, 50 ug/ml), adăugându-se hemolimfa
extrasă de la 1-2 larve. În plus, întrucât de la unele larve s-a extras hemolimfă care conţinea şi mici fragmente
de corp gras, a fost necesară separarea godeurilor cu cultură în două categorii: cu hemolimfă (H) şi cu
hemolimfă + fragmente de corp gras (H+CG).
După 15-45 minute s-au înlocuit 250 ul mediu din fiecare godeu cu câte 950 ul, în final volumul culturii fiind de
1000 ul. Lucrările au fost efectuate la o hotă sterilă cu flux de aer orizontal. Plăcile au fost lipite cu bandă
adezivă, introduse, împreună cu o bucată de şerveţel umed, într-o pungă de plastic (6) şi incubate la o
temperatură iniţială de 25,50C  şi finală de 28,50C în atmosferă normală.
c) Aprecierea parametrilor culturii
Caracterizarea morfologică a fost făcută prin examenul direct cu un microscop optic ranversat (30x, 100x, 200x),
utilizând şi un micrometru ocular, şi prin coloraţia Giemsa modificată (4) a preparatelor efectuate cu suspensie
celulară extrasă din godeuri.
Viabilitatea hemocitelor (GR+OE) a fost evaluată procentual prin tehnica de excludere vitală cu o soluţie 0,5%
trypan blue (6; Yip şi Anersperg, 1972, citaţi de 7). Aprecierea viabilităţii s-a făcut atât în godeuri H cât şi în
godeuri H+CG.
Aceste examinări au fost efectuate din două în două zile, începând cu a 5-a zi de cultură şi până la 14 zile,
pentru culturile obţinute de la L4-5, şi la 11, 18 şi 21 zile de cultivare pentru culturile obţinute de la L6-7.

Rezultate şi discuţii
La o oră de la cultivare, prin examinare directă la microscop, s-au observat numeroase celule rotunde, mici (10-
17 um diametru), cu citoplasma heterocromă, strălucitoare, şi rare celule alungite, poliforme, aderente de
fundul godeului (celule fibroblast-like). În godeurile H+CG au fost observate şi celule mari (40-70 um diametru),
cu aspect muriform, opace precum şi rare celule cu dimensiuni intermediare (20-30 um diametru), ambele
categorii fiind sferice.
La 48 ore de la cultivare, în godeurile H se observă scăderea numărului de celule fibroblast-like (fig. 2, 3, 5),
marea majoritate a celulelor fiind reprezentată de cele mici, sferice, care prezintă heterocromie accentuată
(granule sau vezicule citoplasmatice) şi membrana citoplasmatică evidentă. Granulele/veziculele
citoplasmatice, mari (2-3 um diametru), net delimitate, au conţinut strălucitor (fig. 2, 5). În preparatele colorate
Giemsa, aceste celule au fost cert identificate ca aparţinând grupului granulocite + oenocitoide (GR+OE),
conform criteriilor prezentate anterior, fapt uşor de explicat chiar şi numai prin aceea că larvele au valoarea
procentuală medie a acestui grup de 96%. Van Steenkiste (7) a evidenţiat în culturile de hemocite obţinute de la
L4 şi L5 numai GR. În plus faţă de GR+OE se observă, rar, şi celulele mari şi cele de dimensiuni intermediare
(fig. 4).
În godeurile H+CG, numărul de GR+OE este mai mic decât în godeurile H, predominând celulele mari. Acestea
au heterocromie pronunţată, în interiorul lor distingându-se două zone: o zonă centrală, mai densă, neclar
delimitată, cu aspect muriform (nucleul înconjurat de vezicule intim aderate, diametru de 13-20 um) şi o zonă
periferică, inelară, mai transparentă, conţinând numeroase granule / vezicule cu caractere asemănătoare cu
cele ale GR+OE dar mai mari (3-10 um diametru) (fig. 6, 7). La majoritatea celulelor, membrana citoplasmatică
este evidentă, integră, netedă, existând însă şi celule cu membrana întreruptă, la care granulele sunt în curs de
dispersare (fig. 6, 7). Aceste celule, pe baza caracterelor morfologice descrise, au fost identificate ca fiind
celule grase. Tipul de celulă cu dimensiuni intermediare este cel mai rar, are formă rotundă, nucleul relativ
mare (10-13 m diametru), citoplasma inelară, heterocromie fină, cu granule / vezicule mai mici decât cele de
la celulele grase şi GR+OE (sub 2 m diametru), concentrate spre nucleu, şi membrana observabilă,
luminoasă, delimitată clar (fig. 4, 7). Zona nucleului este mai închisă, iar cea periferică mai strălucitoare.
Aceste celule au fost identificate ca fiind oenocite.
În intervalul 48 ore – 21 zile s-a constatat că GR+OE îşi menţin în general caracterele enumerate dar, după a
14-a zi de la cultivare, membrana citoplasmatică începe să se încreţească, granulele / veziculele se
aglomerează la periferie, uneori chiar proeminând (probabil aflându-se în curs de exocitoză), astfel încât
celulele devin muriforme, rămânând însă vii. De asemenea, creşte proporţia celulelor grase dezintegrate, din
acestea rămânând un număr mic de granule / vezicule ataşate de nucleu, restul acestora fiind dispersate în
mediu. În plus, membrana oenocitelor devine tot mai greu de observat, celulele intrând probabil, într-un proces
de dezintegrare.
Pentru GR+OE de L4-5, viabilitatea, în intervalul 5-14 zile, a variat între 81,1% (în a 5-a zi) şi 90,2% (în a 9-a zi).
Pentru GR+OE de L6-7 viabilitatea în intervalul 14-21 zile, a variat între 90,4% (în a 14-a zi) şi 60,7% (în a 21-a
zi). Valorile viabilităţii înregistrate pentru culturile de GR+OE de la L4-5 şi L6-7 sunt prezentate în tabelul 1 şi
redate grafic în figura 1, comparativ cu cele obţinute de Van Steenkiste pentru GR provenite de la L5, la
temperatura de 250C.

După o evoluţie ascendentă a viabilităţii până în a 9-a zi s-a înregistrat o uşoară scădere până în a 12-a zi şi
menţinerea în platou până în a 14-a zi, pentru GR+OE de L4-5 examinarea fiind oprită în a 14-a zi datorită
infectării culturii. Pentru GR+OE de L6-7 examinarea viabilităţii s-a efectuat numai în zilele 14, 18 şi 21 de la
cultivare înregistrându-se, după o valoare foarte apropiată de cea a hemocitelor de L4-5 la 14 zile o uşoară
scădere a viabilităţii în a 18-a zi, urmată de o scădere accentuată în a 21-a zi. Nu s-a putut continua examinarea
culturii de L6-7 datorită epuizării numărului de godeuri.
Din fig. 1 se observă faptul că valorile supravieţuirii GR+OE de L4-5 înregistrate de noi, pentru intervalul 5-14
zile, sunt ceva mai mici decât cele obţinute de Van Steenkiste pentru GR de L5 cu până la 16% (în a 5-a zi)
probabil datorită incubării culturii la 25,5 – 28,50C, faţă de 250C, temperatura utilizată de Van Steenkiste (7).
La 18-21 de zile (probabil chiar din a 16-a zi) rezultatele noastre (pentru GR+OE de L6-7) sunt mai bune decât
cele ale lui Van Steenkiste, pentru GR de L5.

Concluzii
S-a reuşit stabilirea unui protocol de lucru pentru obţinerea de culturi de hemocite. Au fost obţinute culturi
primare de hemocite (± fragmente de corp gras) de la larve de albine lucrătoare în vârstă de 4-5 zile respectiv 6-
7 zile. Au fost caracterizate morfologic şi identificate atât hemocitele (GR+OE) cât şi celulele din fragmentele de
corp gras (celule grase şi oenocite).
A fost apreciată viabilitatea GR+OE pentru intervalul 5-21 zile, de menţinere a celulelor în cultură. Astfel, pentru
GR + OE de L 4-5, viabilitatea, în intervalul 5 – 14 zile, a variat între 81,1% (în a 5-a zi) şi 90,2% (în a 9-a zi), iar
pentru GR+OE de L6-7, în intervalul 14-21 zile, aceasta a variat între 90,4% (în a 14-a zi) şi 60,7% (în a 21-a zi).

Tabelul 1. Valorile viabilităţii înregistrate pentru culturile de GR+OE (granulocite + oenocitoide) provenite de la
larve şi albine în vârstă de 4 – 5 zile (L4-5) respectiv 6 – 7 zile (L6-7)

Timp (zile)        Viabilitate (%)
GR+OE (L4-5) GR+OE (L6-7)
5                81,1        ND
7                84,9        ND
9                90,2        ND
12             88,5        ND
14             88,5        90,4
18              ND        87,3
21              ND        60,7
ND = nedeterminat

Încercări de cultivare “in vitro” a hemocitelor albinei melifere, Apis mellifera L.

I. Sorescu1, R. Tănasă1, Lenuţa Gheorghe1, Aneta Mardare2, Gabriela Chioveanu2

1. S.N. “Institutul Pasteur” S.A. Bucureşti
2. Institutul de Diagnostic şi Sănătatea Animală
Bibliografie

1. Giauffret A. (1971) – Cell culture of Hymenoptera. In:
Vago C (Ed), Invertebrate tissue culture, Academic Press,
New York, Vol 1, 295 - 305
2. Snodgrass R.E. (1956) – Anatomy of the honey bee.
Comstock Publishing Associates, Ithaca, New York, 5-9, 205
3. Sorescu I. (1998) – Cercetări privind răspunsul imun în
principalele boli bacteriene şi micotice ale albinei
melifere, Apis mellifera L. Teză de doctorat, USAMV
Bucureşti, 245-292
4. Sorescu I., Turcu D. (1998) – Contribuţii privind
hemocitele albinei melifere (Apis mellifera L.): caractere
morfologice, multiplicare şi răspândire în organism. Studii
şi Cercetări de Medicină Veterinară (Institutul Pasteur)
5. Stanley M. (1968) – Initial results of honey bee tissue
culture. Bulletin Apicole, T11, No. 1, 45-55
6. Summers M.D., Smith G.E. (1987) – A manual of
methods for baculovirus vectors and insect cell culture
procedures. Texas Agriculture Experiment Station Bulletin
No. 1555, Texas
7. Van  Steenkiste  D.  (1988)  -  De  hemocyten  van  de  
honingbij  (Apis mellifera L.): typologie, bloedbeeld en
cellulaire verdedigingsreacties. Doctoraatsproefschrift,
Rijksuniversiteit Gent, Belgium, 95-105
Antibiogram
Encyclopedia
Culture media
Biochemical tests
Stainings
Images
Movies
Articles
Identification
Software
R E G N U M
PROKARYOTAE
Previous page
Back